Fiche 41. Séquençage des acides aminés : méthodes enzymatiques et génétiques

En plus des méthodes chimiques, le séquençage des acides aminés engagés dans un polypeptide nécessite aussi des approches enzymatiques et « in silico ».
Il s’agit d’utiliser des exopeptidases et des endopeptidases de faible ou de grande spécificité sur des fragments peptidiques obtenus par hydrolyse enzymatique ménagée avec la protéinase K ou avec la papaïne.
Les exoprotéases coupent les liaisons peptidiques à partir de l’extrémité N-terminale avec une aminopeptidase ou à partir de l’extrémité C-terminale avec une carboxypeptidase. La figure 1 montre l’action ménagée d’une aminopeptidase en fonction du temps par le suivi en chromatographie sur couche mince. On voit apparaître des spots à des temps différents que l’on identifie grâce à des standards. Il s’agit ici encore d’une méthode récurrente puisque la séquence N-terminale correspond à l’ordre d’apparition des spots.
L’utilisation d’une carboxypeptidase donne le même type de résultats du côté C-terminale.
Le tableau 1 présente l’utilisation d’endoprotéases à coupures spécifiques en fonction des acides aminés engagés dans la liaison peptidique.Les méthodes chimiques et enzymatiques sont souvent combinées sur des peptides obtenus après hydrolyse acide ménagée (HCl, 6 h, 80 °C). On obtient alors des peptides chevauchants, comme illustré dans l’exercice ci-dessous.
Grâce à la découverte du code génétique par l’équipe de Nirenberg et par la suite à la mise au point de la technique de séquençage de l’ADN par Sanger et Coulson, il est maintenant possible de déduire indirectement à l’aide d’un petit programme informatique la séquence en acides aminés d’un polypeptide à partir de la séquence des codons dans une séquence nucléotidique de la (ou des) partie(s) codante(s) d’un gène…