Fiche 65. Techniques de séquençage de l’ADN

Le séquençage de l’ADN permet de déterminer la succession linéaire des nucléotides prenant part à la structure de l’ADN. Les deux techniques initiales sont la méthode chimique de Maxam et Gilbert et la méthode enzymatique de Sanger. Plus récemment apparaît la méthode du pyroséquençage. La méthode chimique, qui n’est plus utilisée, ne sera pas décrite.
Il s’agit d’incorporer dans la chaîne polynucléotidique en croissance des désoxyribonucléotides (dNTP) et des didésoxyribonucléotides (ddNTP) qui diffèrent des dNTP par l’absence d’un groupement OH en position 3’ du désoxyribose. Ceci empêche l’ADN polymérase d’ajouter le moindre nucléotide: la synthèse du brin d’ADN s’arrête (figure 1).La réaction est effectuée dans quatre tubes différents contenant chacun l’ADN à séquencer, une amorce complémentaire du brin à séquencer, les dNTP, une ADN polymérase, puis dans chaque tube est ajouté un ddNTP différent.
Après incubation, chaque tube contient un mélange de fragments dont la synthèse a été interrompue suite à l’incorporation d’un ddNTP. Les fragments synthétisés sont révélés soit par un marqueur radioactif (dATP radioactif), soit par des fluorophores (amorce fluorescente). Les différents fragments sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, suivie soit d’une autoradiographie dans le cas du marquage radioactif, soit d’une détection de la fluorescence (figure 2). Aujourd’hui l’analyse est réalisée par électrophorèse capillaire. L’automatisation de cette méthode a ouvert la voie du séquençage à haut débit…