Fiche 124. Modification d’un gène et de son expression

Dans le cadre de l’étude de la fonction d’un gène, il est parfois intéressant de modifier ponctuellement un codon (mutagenèse dirigée), ou l’expression de ce gène dans une cellule (sur- ou sous-expression) afin de mieux comprendre le fonctionnement de la protéine.
Cette technique permet de modifier ponctuellement un gène en remplaçant une ou des bases pour modifier la séquence protéique. Deux méthodes sont utilisées pour réaliser une mutagenèse dirigée.
Un oligonucléotide d’une vingtaine de paires de bases contenant en son centre la mutation à introduire est hybridé à la séquence d’ADN simple brin à muter. Cet ADN matrice a été amplifié dans une souche d’E. coli déficiente en uracile déglycosidase (ung–) de manière à permettre l’incorporation d’uracile à la place de thymine. Cette amorce sert alors à l’ADN polymérase pour répliquer le brin matrice in vitro, aboutissant à un duplex brin sauvage-brin muté. Après ligation, ce plasmide est introduit dans une souche d’E. coli ung+. Le brin sauvage (contenant des U) va être attaqué par l’uracile déglycosidase et dégradé tandis que le brin muté sera répliqué normalement, introduisant la mutation dans le plasmide.
Pour introduire la mutation, il va falloir produire deux fragments mutés et chevauchant du gène (figure 1). Puis les deux fragments sont incubés ensemble en présence des amorces 1 et 4 pour amplifier par PCR le gène entier et muté. Lors du premier cycle de PCR, les fragments sont dénaturés puis se réassocient au niveau des séquences mutées chevauchantes…