Test sur DPPH

9 La méthode de Braca et al. [17] a été utilisée pour la détermination de l'activité de piégeage du radical libre DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Brièvement, 1,5 ml de différentes concentrations de l'extrait préparé dans du méthanol (comprises entre 5 à 1 000 μg/ml) ont été ajoutés à un volume égal de la solution méthanol/DPPH fraîchement préparée (0,004 % m/v). Le mélange réactionnel a été agité au vortex et maintenu à l'obscurité pendant 30 minutes. L'absorbance a été ensuite lue à 517 nm contre le blanc contenant l'extrait sans DPPH. Le α-tocophérol (vitamine E) et le BHT (hydroxytoluènebutylé) ont été utilisés comme standards. La manipulation a été répétée trois fois.

10 La capacité antiradicalaire des échantillons a été exprimée en pourcentage en suivant l'équation :

11 % activité antiradicalaire = [1 − (Abs_échantillon − Abs_témoin)] × 100
Abs_échantillon correspond à l'absorbance de l'échantillon ou du standard après 30 minutes.
Abs_témoin correspond à l'absorbance du témoin contenant uniquement la solution DPPH.

12 La valeur d'IC₅₀, la concentration de l'extrait nécessaire pour piéger 50 % de radicaux libres, a été calculée par régression linéaire des pourcentages d'inhibition calculés en fonction de différentes concentrations d'échantillons préparés.

Test de blanchiment du β-carotène

13 Cette méthode a été réalisée selon le protocole décrit par Shon et al. [18]. Deux milligrammes de β-carotène ont été dissous dans 10 ml de chloroforme (grade CLHP). Un millilitre de cette solution a été introduit dans un ballon contenant au préalable 20 mg d'acide linoléique et 200 mg de Tween 40. Le chloroforme a été ensuite évaporé en utilisant un évaporateur sous vide. Cent millilitres d'eau distillée ont été ajoutés lentement au résidu ainsi obtenu avec agitation vigoureuse pour former une émulsion stable. 4,8 ml de l'émulsion ont été transférés dans des tubes et 0,2 ml de l'extrait (2 mg/ml dans le méthanol) ou d'antioxydant de référence (BHT, α-tocophérol) ont été ajoutés. La cinétique de décoloration de l'émulsion en présence et en absence de l'échantillon (témoin) a été suivie à 470 nm à des intervalles de temps réguliers pendant deux heures (0, 30, 60, 90, 120 minutes). L'absorbance a été lue contre le blanc préparé de la même manière sauf qu'il ne contient pas de β-carotène. L'expérience a été faite en triplicate.

14 Le taux de blanchiment de β-carotène (R) a été calculé selon une cinétique de premier ordre, tel que décrit par Al-Saikhan et al. [19] :

15 Rt = [In (Abs_t0/Abs_t)]/t

16 Rt : le taux de blanchiment de β-carotène aux temps 30, 60, 90 ou 120 minutes ;

17 In : logarithme naturel ; Abs_t0 correspond à l'absorbance initiale de l'émulsion, immédiatement après la préparation de l'échantillon (t = 0 minute) ; Abs_t : l'absorbance de l'émulsion aux temps 30, 60, 90 ou 120 minutes.

18 Le pourcentage de l'activité antioxydante a été calculé en utilisant l'équation suivante :

19 Activité antioxydante% = [(R_témoin − R_échantillon)/R_témoin] × 100

20 R_témoin et R_échantillon sont des taux moyens de blanchiment de témoin et d'échantillons (extrait et standards), respectivement.

Animaux et conditions d'hébergement

21 Les animaux d'expériences fournis par l'institut Pasteur (Alger) sont des souris albinos (la souche Swiss), adultes de deux sexes pesant 20 à 25 g. Dès leur réception, les souris ont été placées dans des cages standardisées et maintenues dans une animalerie à température constante (25 ± 1 °C), soumises à un cycle de 12 heures de lumière/12 heures d'obscurité. Pendant la période d'acclimatation (une semaine avant d'être utilisées dans les différentes expériences), les souris avaient un accès libre à l'eau et à la nourriture (croquettes provenant de la société de production des aliments d'animaux, Bouzaréah, Alger).

Recherche de la toxicité

22 La dose létale moyenne (LD₅₀) des extraits d’Origanum glandulosum n'est pas connue dans la littérature consultée ; ainsi, la recherche d'une éventuelle toxicité de ses extraits est nécessaire pour réaliser les études in vivo. L'EHM de cette plante a été préparé dans une solution physiologique (NaCl 0,9 %) contenant 3 % DMSO à des doses de 100, 500, 1 000 mg/kg de masse corporelle.

23 Ces extraits ont été administrés par gavage gastrique (voie orale) aux groupes de six souris, qui ont été ensuite mises à l'observation durant 72 heures concernant les symptômes de toxicité et le taux de mortalité [20].

Œdème de la patte induit par la carragénine

24 La méthode de l'œdème à la carragénine de Winter et al. [21] a été utilisée. Un œdème aigu a été induit par l'injection de 0,05 ml d'une suspension de 1 % de carragénine dans du sérum physiologique sous l'aponévrose plantaire de la patte postérieure droite. L'épaisseur de la patte a été mesurée par un pied à coulisse numérique avant l'injection de la carragénine et quatre heures après à des intervalles de temps de zéro, une, deux, trois et quatre heures. Une heure avant l'injection de la carragénine, des lots de six souris avaient reçu, par voie orale, les différents traitements suivants :

• un lot témoin recevant de l'eau physiologique ;
• un lot traité par l'aspirine (produit de référence) : 100 mg/kg ;
• deux lots traités par l'EHM à 100 et 200 mg/kg.

25 L'activité anti-inflammatoire a été calculée en pourcentage de réduction de l'œdème chez les souris traitées par rapport au témoin selon la formule suivante :

26 % d'inhibition de l'œdème = [(E_t – E₀)_{souris témoin} – (E_t – E₀)_{souris traitée}]/(E_t – E₀)_{souris témoin}

27 E_t = épaisseur de la patte après quatre heures.

28 E₀ = épaisseur de la patte immédiatement après l'injection de la carragénine.

Œdème de l'oreille induit par l'huile de croton

29 L'étude de l'activité anti-inflammatoire en utilisant ce modèle a été réalisée selon le protocole décrit par Sosa et al. [22]. L'inflammation cutanée a été induite sur la surface interne du pavillon de l'oreille droite de la souris, et cela par l'application de 10 μl d'une solution acétonique de l'huile de croton (5 %). L'oreille gauche non traitée a servi de témoin. Cinq microlitres de différentes doses de la solution de substance à étudier ont été appliqués localement à l'oreille droite 30 minutes avant le dépôt de la solution de l'huile de croton. Les différents lots de souris (n = 6) ont été traités comme suit :

• un lot témoin ne recevant que la solution de l'huile de croton ;

30 – un lot recevant l'aspirine (0,5 mg/oreille) + la solution de l'huile de croton ;

• deux lots recevant l'EHM (1 et 2 mg/oreille) + la solution de l'huile de croton.

31 Quatre heures après l'induction de l'inflammation, les souris ont été sacrifiées. Les oreilles droite et gauche ont été alors sectionnées au ras de leur implantation. À l'aide d'une perce bouchon de 5,5 mm de diamètre, un morceau du pavillon de l'oreille a été prélevé au niveau de la marge en pointe et pesé immédiatement.

32 L'activité anti-inflammatoire topique a été calculée selon la formule suivante :

33 % d'inhibition de l'œdème = [(PD – PG)_{souris témoin} – (PD – PG)_{souris traitée}]/(PD – PG)_{souris témoin}

34 PD = poids de l'oreille droite.

35 PG = poids de l'oreille gauche.

Toxicité des plantes chez la souris

53 Au cours de cette étude, nous n'avons constaté aucun symptôme de toxicité et aucune mortalité chez les souris ayant reçu par voie orale l'EHM d’Origanum glandulosum aux doses de 100, 500 et 1 000 mg/kg. La LD₅₀ est donc supérieure à 1 g/kg. Ces résultats révèlent que l'utilisation des doses inférieures à 1 000 mg/kg ne présente aucun risque sur les animaux d'expérience.

Activité anti-inflammatoire

54 L'inflammation aiguë est caractérisée par des symptômes classiques : la chaleur, la rougeur, le gonflement et la douleur. La mesure de l'œdème, induit par différents agents phlogistiques, constitue donc un excellent outil pour la quantification de l'inflammation.

55 Deux modèles d'inflammation in vivo ont été utilisés dans la présente étude : l'œdème de la patte induit par la carragénine et l'œdème de l'oreille induit par l'huile de croton.

Modèle d'œdème de la patte

56 Les résultats sont représentés sous forme de courbes mettant en valeur l'évolution de l'épaisseur de l'œdème en fonction du temps (Fig. 3). Chez les souris du lot témoin, l'injection de 50 μl de la solution de carragénine à 1 % sous l'aponévrose plantaire de la patte postérieure droite provoque une inflammation visible dans l'heure qui suit cette injection (l'épaisseur de l'œdème est de 3,21 ± 0,34 mm), l'œdème augmente progressivement et atteint 4,00 ± 0,46 mm au bout de quatre heures.

Fig. 3

Courbe de l'évolution de l'œdème de la patte (mm) en présence d'un prétraitement par voie orale une heure avant l'injection de la carragénine, chez huit lots de souris : lot témoin (eau physiologique) ; lot de référence (aspirine préparée à 100 mg/kg ; lots des extraits d’Origanum glandulosum préparés à 100 et à 200 mg/kg. Chaque point représente une moyenne de six animaux

Courbe de l'évolution de l'œdème de la patte (mm) en présence d'un prétraitement par voie orale une heure avant l'injection de la carragénine, chez huit lots de souris : lot témoin (eau physiologique) ; lot de référence (aspirine préparée à 100 mg/kg ; lots des extraits d’Origanum glandulosum préparés à 100 et à 200 mg/kg. Chaque point représente une moyenne de six animaux

57 Cependant, l'administration par voie orale de nos extraits inhibe significativement le développement de l'œdème de manière dose-dépendante, avec une cinétique d'action semblable à celle de l'aspirine (molécule de référence) (Fig. 3). L'analyse statistique des résultats ne révèle aucune différence significative entre l'effet de l'aspirine (à 100 mg/kg) et celui de l'EHM (à 200 mg/kg) qui ont induit une inhibition respective de 84,08 ± 5,84 % et 83,44 ± 5,06 %.

58 La réaction inflammatoire induite par la carragénine est biphasique ; la phase initiale (une heure) est attribuée à la libération de l'histamine, de la sérotonine et des bradykinines. En conséquence, la perméabilité vasculaire est augmentée, ce qui facilite l'infiltration de neutrophiles et de l'accumulation du plasma dans l'espace interstitiel qui conduit à un œdème. Les facteurs d'activation des plaquettes et des métabolites de l'acide arachidonique jouent également un rôle. L'induction de l'œdème pendant la phase tardive (après une heure) est associée à la production de la cyclo-oxygénase (COX) qui augmente la synthèse des prostaglandines (PGs) essentiellement les PGE2, la production de radicaux libres d'oxygène et l'infiltration massive de neutrophiles [25–27]. De ce fait, la réduction significative de l'épaisseur de l'œdème observée lors de prétraitement des souris par notre extrait indique que ce dernier contient des substances anti-inflammatoires dont le mécanisme d'action est probablement lié à l'inhibition de la synthèse des PGs par blocage des enzymes COX.

Modèle d'œdème de l'oreille

59 Le modèle de l'œdème de l'oreille induit par des agents irritants permet d'identifier des composés anti-inflammatoires stéroïdiens et non stéroïdiens, qui peuvent être potentiellement utiles dans le traitement des maladies inflammatoires de la peau [28,29]. L'effet phlogénique de l'huile de croton est dû principalement au principe actif 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA) qu'elle contient. Le TPA induit une réaction inflammatoire caractérisée par une production importante de médiateurs pro-inflammatoires, une augmentation de la perméabilité vasculaire et un œdème. Cette réaction est déclenchée par l'activation de la protéine-kinase C (PKC), qui favorise une augmentation de phospholipase A2 (PLA2). Cette enzyme catalyse l'hydrolyse des phospholipides membranaires en acide arachidonique. L'oxydation enzymatique de ce dernier par les cyclo-oxygénases ou par les lipo-oxygénases conduit à la formation des éicosanoïdes, PGs, leucotriènes et cytokines [29].

60 Comme le montre le Tableau 2, quatre heures après l'application de l'huile de croton sur l'oreille droite par voie topique, les souris du groupe témoin ont développé un œdème d'un poids de 5,33 mg. Chez les souris du groupe traité localement par 0,5 mg d'aspirine, on remarque une réduction très significative (p < 0,05) du poids de l'oreille par rapport à celui des souris du groupe témoin qui passe de 5,33 à 1,40 mg, ce qui correspond à une inhibition de l'inflammation de 73,73 %. Les extraits d’Origanum glandulosum ont montré une activité anti-inflammatoire dose-dépendante. Le traitement des souris par 2 mg d'EHM induit une diminution très significative (p < 0,05) de l'inflammation par rapport aux souris du groupe témoin avec une inhibition de l'œdème de 72,98 %. Cette valeur ne diffère pas significativement de celle de l'aspirine (produit de référence).

Tableau 2

Effet de l'extrait hydrométhanolique d’Origanum glandulosum sur l'œdème de l'oreille induit par l'huile de croton chez les souris

Traitements	Dose (mg/oreille)	Différence du poids (oreilles gauche et droite) [mg]	% d'inhibition de l'œdème
Témoin	–	5,33 ± 0,30	–
EHM d’Origanum glandulosum	1,0	3,40 ± 0,50	36,21 (b)
	2,0	1,44 ± 0,30	72,98 (a)
Aspirine	0,5	1,40 ± 0,68	73,73 (a)

Effet de l'extrait hydrométhanolique d’Origanum glandulosum sur l'œdème de l'oreille induit par l'huile de croton chez les souris

Les lettres différentes indiquent des activités significativement différentes (p < 0,05)

61 Les résultats obtenus à travers ce test montrent que l'extrait d’Origanum glandulosum a une forte activité anti-inflammatoire, cela suggère que cet extrait pourrait agir sur la PLA2, la COX et/ou la lipo-oxygénase qui sont les principaux médiateurs impliqués dans la réaction inflammatoire induite par le TPA. Ces propriétés anti-inflammatoires seraient liées au profil chimique de cet extrait, particulièrement à la présence des composés phénoliques (lutéoline, quercitine, apéginine, catéchine, acide férulique, acide rosmarinique, acide coumarique) qui sont en effet de puissants antioxydants capables d'inhiber l'activité enzymatique.

Activité cytotoxique

62 Après une exposition de 24 heures à l'extrait testé, le pourcentage de mortalité des larves a été déterminé. D'après les résultats obtenus, ce pourcentage croît en fonction de la concentration de l'extrait, et le maximum de mortalité (100 %) a été obtenu à partir de 1 000 μg/ml. Cela est bien illustré par la courbe représentée sur la Figure 4 qui présente les pourcentages de mortalité en fonction de logarithme des concentrations.

Fig. 4

Courbe représentant le pourcentage de mortalité en fonction de la concentration de l'extrait hydrométhanolique d’Origanum glandulosum

Courbe représentant le pourcentage de mortalité en fonction de la concentration de l'extrait hydrométhanolique d’Origanum glandulosum

63 Selon Meyer et al. [30], les extraits végétaux sont toxiques (actifs) si leur valeur LD₅₀ est inférieure à 1 000 μg/ml, alors qu'ils sont non toxiques (non actifs) si elle est supérieure à 1 000 μg/ml. De plus, l'activité cytotoxique est considérée faible lorsque la valeur LD₅₀ est comprise entre 1 000 et 500 μg/ml, modérée quand elle est entre 500 et 100 μg/ml et forte quand elle est comprise entre 100 et 0 μg/ml. Dans la présente étude, l'extrait d’Origanum glandulosum a montré une valeur LD₅₀ inférieure à 100 μg/ml (17,64 μg/ml), indiquant ainsi la présence des composés fortement cytotoxiques responsables de l'activité observée contre les larves d’Artemia salina.

64 Dans de nombreux cas, une corrélation générale de ce test avec des types spéciaux de bioactivités s'est avérée possible [31]. Plusieurs auteurs ont pu déterminer une corrélation positive entre la mortalité des larves d’Artemia salina et la cytotoxicité contre les cellules cancéreuses, démontrant ainsi l'utilité de ce test comme un préscreening antitumoral des extraits végétaux [32–34].

65 De ce fait, la cytotoxicité de notre plante laisse entrevoir l'existence des effets anticancéreux sachant que l'analyse par CLHP de notre extrait a permis de déceler la présence des substances anticancéreuses très puissantes telles que l'acide rosmarinique, l'acide férulique, l'acide coumarique, la lutéoline, la quercétine, l'apigénine et la catéchine.