Matériel végétal

3 Les feuilles de l'espèce Olea europaea ont été récoltées dans la région de Larbaatach, wilaya de Boumerdès au mois d'octobre 2011. Après leur identification, les feuilles récoltées et triées sont nettoyées puis mises à sécher à température ambiante dans un endroit aéré à l'ombre et ensuite finement broyées.

Matériel animal

4 Les différentes activités biologiques in vivo ont été effectuées sur des souris albinos de souche Swiss provenant de l'institut Pasteur (Alger). Au total, une centaine de souris de sexe mâle et dont le poids varie entre 20 et 28 g ont été utilisées. Ces animaux ont été stabulés dans des cages en plastique à la température ambiante (25 °C), et un éclairage de 12 heures par jour, avec un régime alimentaire de granulés d'origine ONAB et de l'eau ad libitum.

Extraction par macération

5 Vingt grammes de poudre des feuilles d’Olea europaea sont mises à macérer dans 600 ml de méthanol absolu pendant 48 heures à température ambiante du laboratoire. L'opération de macération est répétée trois fois avec renouvellement du solvant pour extraire le maximum du produit bioactif. Après filtration sur papier filtre, le méthanol est éliminé du filtrat par évaporation sous pression réduite dans un rotavapeur (BÜCHI). Le résidu sec pesé est conservé à 4 °C.

Détermination du rendement

6 Le poids en extrait sec est déterminé par la différence entre le poids du ballon plein (après évaporation) et le poids du ballon vide.

Analyse de l'extrait méthanolique par chromatographie liquide à haute performance

7 La technique analytique de CLHP a été utilisée pour les composés phénoliques de l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea. L'élution a été réalisée à température ambiante de 23 °C en mode gradient grâce à un mélange de solvants binaire composé d'eau acidifiée par 5 % d'acide chlorhydrique (solvant A) et de méthanol à 100 % (solvant B). Le flux de la phase mobile est de 0,6 ml/min, et le volume d'injection de chaque échantillon était de 20 μl. Les composés phénoliques ont été détectés à 254, 265, 280, 293, 320 nm. Les pics des composés phénoliques ont été identifiés par comparaison de leur temps de rétention à ceux des standards et en vérifiant leur spectre caractéristique.

Dosage colorimétrique

Étude de la toxicité

13 Plusieurs concentrations en extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea ont été testées (600, 1 000, 2 000, 4 000 mg/kg), diluées dans l'eau physiologique (NaCl 0,9 %). Nous avons constitué cinq lots contenant chacun six souris. Le premier recevra par voie orale l'eau physiologique (témoin –), et les autres lots sont traités par les différentes concentrations de l'extrait méthanolique qui sont ensuit mises à l'observation durant 72 heures concernant les symptômes de toxicité et le taux de mortalité [8].

Étude de l'activité anti-inflammatoire in vivo

Étude de l'activité antalgique (test de contorsion)

24 Cette étude a été réalisée selon la méthode de Collier et al. [12]. Elle consiste à réduire, par substance antalgique, la douleur provoquée chez les souris par l'injection d'une substance irritante capable d'entraîner des mouvements de torsion.

25 L'activité antalgique a été évaluée sur des torsions provoquées par administration intrapéritonéale de la solution d'acide acétique à des souris. Les animaux ont été mis à jeun 12 heures avant l'expérimentation et pesés. Dans cette étude, cinq lots ont été constitués contenant chacun six souris. Les différentes concentrations d'extrait sont administrées par voie orale à l'aide d'une sonde gastrique selon les concentrations suivantes :

• lot témoin : la solution d'eau physiologique ;
• lot de référence : la solution de l'aspirine à la concentration de 100 mg/kg ;
• lot traité 1 : la solution de l'extrait à la concentration de 200 mg/kg ;
• lot traité 2 : la solution de l'extrait à la concentration de 400 mg/kg ;
• lot traité 3 : la solution de l'extrait à la concentration de 600 mg/kg.

26 Une heure après administration orale d'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea, une injection de 0,2 ml d'une solution d'acide acétique à 3 % par voie intrapéritonéale à des souris. Le nombre de contorsions (NC) pour chaque souris est compté dix minutes après l'injection de l'acide acétique pendant dix minutes.

27 % de réduction de la douleur = [(ΔT – ΔE)/ΔT] × 100

28 ΔT : moyenne du nombre de contorsions dans le lot témoin – (eau physiologique 0,9 % NaCl).

29 ΔE : moyenne du nombre de contorsions dans le lot essai (extrait méthanolique ou témoin +).

Étude de l'activité cytotoxique par le test de « Brine shrimp »

30 Récemment, plusieurs tests de toxicité sont développés pour lesquels la réponse a été mesurée chez les invertébrés. Ces tests sont souvent peu coûteux, reproductibles et faciles. L’Artemia salina est largement utilisée dans les applications toxicologiques.

31 Ce test est très utile pour établir la cytotoxicité d'extraits de la plante. Il permet également la détermination de la concentration qui tue 50 % des Artemia (DL₅₀) pendant 24 heures sous des conditions standardisées [13]. Les œufs de crevettes (Artemia salina) ont été fournis par le Centre national de recherche, de développement et de la pêche (CNRDPA), Tipaza. Environ 1 g d'œufs de crevettes sont placés dans un récipient rectangulaire en plastique muni d'une source d'oxygène contenant initialement 1 l d'eau de mer préparée (36 g de sel de mer dans 1 l d'eau distillée). Après une période d'éclosion de 24 heures à 26 °C et à lumière constante, les larves sont récupérées et comptées en utilisant un microscope.

32 L'extrait méthanolique des feuilles d'olivier est solubilisé dans l'eau salée de manière à obtenir une concentration de 10 000 μg/ml pour obtenir les concentrations suivantes : 1 000, 100, 10, 1 μg/ml. 2,5 ml de chaque concentration sont ajoutés aux tubes à essai contenant chacun dix larves d’Artemia salina. Trois répétitions ont été réalisées pour chaque concentration. Une solution saline sans extrait ajouté est utilisée comme témoin. Le pourcentage de mortalité des larves est déterminé après 24 heures d'incubation à l'obscurité et à la température ambiante. Les larves survivantes sont comptées à l'aide d'une loupe binoculaire, et le pourcentage de mortalité est déterminé en utilisant la formule suivante :

33 % Mortalité = (NLM/NLT) × 100

34 NLM : nombre de larves mortes ; NLT : nombre de larves testées.

35 La dose DL₅₀ est déterminée à partir de la courbe de régression qui exprime le pourcentage des larves tuées en fonction du logarithme de la dose de l'échantillon testé.

Étude statistique

36 Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type. La signification statistique a été déterminée au moyen du test d'analyse de variance à un facteur (Anova), suivi par le test de Turky pour comparaison par paires. Une valeur de p inférieure à 0,05 a été considérée comme différence significative. L'étude statistique a été réalisée à l'aide du logiciel XLStat 2012.

Détermination du rendement

37 Les résultats obtenus montrent que l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea représente un rendement de 26,96 % par rapport à la matière végétale sèche.

Dosage colorimétrique des polyphénols totaux et des flavonoïdes

38 Les résultats des polyphénols totaux des feuilles d'olivier sont exprimés en mg EAG/g d'extrait plante (Fig. 1). L'estimation quantitative des polyphénols totaux montre que l'extrait de méthanol d’Olea europaea est riche en composés phénoliques (115,35 ± 2,24 mg EAG/g d'extrait).

Fig. 1

Droite d'étalonnage de l'acide gallique pour le dosage des polyphénols totaux

Droite d'étalonnage de l'acide gallique pour le dosage des polyphénols totaux

39 Les résultats du dosage des flavonoïdes sont exprimés en mg EQ/g d'extrait (Fig. 2). Nos résultats montrent que l'extrait de méthanol d’Olea europaea (7,19 ± 0,19 mg EQ/g d'extrait) est riche en flavonoïdes. Dans une étude faite sur huit variétés d'olivier, Ben Salah et al. [14] ont déterminé la teneur des composés phénoliques des feuilles d'un extrait éthanolique (7/3 (v/v)). Ils ont trouvé que les teneurs des polyphénols totaux et des flavonoïdes varient entre 73 et 144 mg EAG/g et 56 et 125 mg EQ/g respectivement. Ces teneurs sont relativement élevées. Nashwa et Abdel-Aziz [15] montrent que les teneurs des polyphénols totaux et des flavonoïdes dans l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea sont de l'ordre de 90,48 mg EAG/g et 21,45 mg EQ/g respectivement. Ce résultat est relativement similaire à celui trouvé dans nos études. Dans une étude faite sur la même espèce végétale pour un extrait méthanolique, Abaza et al. [16] ont déterminé la teneur en polyphénols totaux (24 mg EAG/g), ils ont trouvé que cette teneur est relativement faible.

Fig. 2

Droite d'étalonnage de la quercétine pour le dosage des flavonoïdes

Droite d'étalonnage de la quercétine pour le dosage des flavonoïdes

Analyse de l'extrait par chromatographie liquide à haute performance

40 Une analyse chromatographique, par CLHP, a été effectuée pour étudier la composition phénolique dans l'extrait méthanolique des feuilles d'olivier. Afin d'identifier nos composés séparés, nous avons utilisé plusieurs standards des acides phénoliques et des flavonoïdes de différentes natures (Fig. 3) (Tableau 1). La comparaison des temps de rétention et des spectres UV des pics obtenus avec ceux des standards nous a permis d'identifier ces composés phénoliques dans l'extrait d'olivier : la rutine, la naringine et la naringénine.

Tableau 1

Temps de rétention des différents témoins polyphénoliques obtenus par la séparation avec HPLC

No de pic	Composé phénolique	tR (min)	λ max (nm)
1	Acide gallique	5,34	272,5
2	Acide caféique	15,25	327
3	Rutine	27,98	354,5
4	Naringine	29,83	288,9
5	Quercétine	35,62	372,7
6	Naringénine	37,14	292,2
7	Hespérétine	37,81	291,1
8	Kaempférol	39,02	362,9
9	Apigénine	39,79	344,4
10	Flavone	45,08	325,9
11	Metoxyflavone	45,99	325,0
12	Gossypine	50,75	382,4

Temps de rétention des différents témoins polyphénoliques obtenus par la séparation avec HPLC

Fig. 3

Chromatogramme HPLC des standards visibles à 254 nm (acide gallique, acide caféique, rutine, naringine, quercétine, naringénine, hespérétine, kaempférol, apigénine, flavone, metoxyflavone, gossypine)

Chromatogramme HPLC des standards visibles à 254 nm (acide gallique, acide caféique, rutine, naringine, quercétine, naringénine, hespérétine, kaempférol, apigénine, flavone, metoxyflavone, gossypine)

Étude de la toxicité

41 Les résultats obtenus ne montrent aucun symptôme de toxicité et aucune mortalité chez les différents essais des souris ayant reçu par voie orale l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea aux concentrations de 600, 1 000, 2 000, 4 000 mg/kg.

Étude de l'activité anti-inflammatoire in vivo

Activité anti-inflammatoire aiguë

42 Les résultats de l'activité anti-inflammatoire sont rapportés sur la figure 4 et dans le tableau 2 qui présentent les variations de la cinétique de réduction de l'œdème des pattes postérieures gauches (PPG) des souris des différents essais (T+, CME) par rapport au témoin négatif (eau physiologique).

Tableau 2

Réduction de l'inflammation au niveau des pattes postérieures gauches des souris

Traitements	Dose (mg/kg)	% réduction de l'œdème
Extrait méthanolique d’Olea europaea	200	93,71 % (a)
	400	96,00 % (a)
	600	97,71 % (a)
Aspirine	100	71,42 % (a)

Réduction de l'inflammation au niveau des pattes postérieures gauches des souris

Fig. 4

Cinétique de réduction de l'œdème dans les pattes postérieures gauches (PPG) des souris de l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea

Cinétique de réduction de l'œdème dans les pattes postérieures gauches (PPG) des souris de l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea

43 L'injection de 100 μl de carragénine à 0,6 %, au niveau de la patte postérieure gauche de souris, provoque une inflammation visible dans les différents lots. Une heure après l'injection, cet œdème diminue progressivement avec le temps jusqu'à la fin de l'expérience (quatre heures). Le témoin négatif, traité avec l'eau physiologique, est le lot qui a présenté l'épaisseur de gonflement le plus important.

44 Durant cette étude cinétique, le prétraitement des souris par l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea a induit une forte inhibition de l'inflammation avec un pourcentage de réduction de 96 % à la concentration de 400 mg/kg.

45 L'inflammation aiguë induite chez la souris par l'injection de la carragénine est un modèle standard et pratique, largement utilisé pour l'évaluation des propriétés anti-inflammatoires de différents agents [17]. La carragénine stimule la libération de l'histamine et de la sérotonine par les mastocytes, débutant par cela une cascade d'événements produisant d'autres médiateurs qui contribuent à l'établissement de la réaction inflammatoire aiguë.

46 D'après nos résultats, l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea exerce une activité anti-inflammatoire remarquable. Lors du traitement de nos souris par 100 mg/kg de l'aspirine, il induit une inhibition significative de l'inflammation de 71,42 %. De nombreux travaux semblent indiquer que les flavonoïdes possèdent des propriétés anti-inflammatoires et qu'ils sont capables de moduler le fonctionnement du système immunitaire, par l'inhibition des enzymes de régulation. Par ailleurs, l'acide arachidonique peut être métabolisé par la voie de la lipo-oxygénase pour aboutir à la formation de leucotriènes et par la voie de la cylo-oxygénase pour produire des thromboxanes et des prostaglandines, molécules fortement impliquées dans le processus inflammatoire. En effet, certains flavonoïdes sont de puissants inhibiteurs de la production des prostaglandines, molécules pro-inflammatoires très actives. Cet effet serait dû à la réduction du métabolisme de l'acide arachidonique par l'inhibition de la lipo-oxygénase, de la cyclo-oxygénase et de la phospholipase A2 [18–20].

47 Les flavonoïdes inhibent la migration des leucocytes en bloquant leur adhésion à la paroi vasculaire. Cet effet serait dû à l'inhibition de la synthèse de l'interleukine-1 (IL-1) et le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α), principaux inducteurs de l'expression des molécules adhésives sur la paroi vasculaire. L'acide gallique, à son tour, inhibe la migration des leucocytes en inhibant les molécules d'adhésion des cellules vasculaires (VCAM-1), les molécules d'adhésion intercellulaires (ICAM-1) et la sélectine-E dans les cellules endothéliales vasculaires. Cette inhibition est due à l'inhibition de l'IL-1, le TNF-α, et le NF-κB. Il a été rapporté, en effet, que la quercétine bloque aussi l'adhésion des leucocytes à la paroi endothéliale des veines ombilicales par l'inhibition de l'expression des ICAM-1 [21,22]. La présence de tanins, de flavonoïdes, et d'anthocyanes dans les feuilles d'olivier contribue à cet effet anti-inflammatoire. Ces composés ont le pouvoir d'inhiber la production de médiateurs pro-inflammatoires tels que les leucotriènes et les prostaglandines (PGI2, PGD2 et PGE2). Cependant, la différence des niveaux d'inhibition entre les deux extraits alcooliques est probablement due à la différence de la composition chimique [23,24].

Activité anti-inflammatoire au niveau de l'œdème de l'oreille

48 L'étude de l'activité anti-inflammatoire de l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea est réalisée par la mesure du pourcentage de réduction de l'œdème induit par l'huile de croton dans les différents essais, par rapport au témoin négatif (eau physiologique 0,9 % NaCl). Les résultats sont représentés dans le tableau 3.

Tableau 3

Réduction de l'inflammation induite dans les oreilles gauches des souris

Traitements	Dose (mg/oreille)	% réduction de l'œdème
Extrait méthanolique d’Olea europaea	0,5	42,42 (b)
	1	26,81 (b)
	2	17,57 (c)
Aspirine	0,5	81,66 (a, c)

Réduction de l'inflammation induite dans les oreilles gauches des souris

49 Le calcul du pourcentage de réduction de l'œdème a révélé que le lot traité par l'extrait méthanolique d'olivier présente un taux élevé où la réduction était de 42,42 % à 0,5 mg/oreille. L'activité anti-inflammatoire locale a été évaluée chez la souris par la mesure de la réaction inflammatoire à l'application locale d'un agent irritant (huile de croton) au niveau de l'oreille [25]. L'application topique de cette huile, qui contient des esters de phorbol, induit une réaction inflammatoire aiguë caractérisée par une vasodilatation, infiltration des leucocytes polynucléaires dans les tissus et la formation de l'œdème [26].

50 Le traitement local des souris par l'extrait méthanolique des feuilles d'olivier (200 mg/kg) conduit à une réduction significative de la taille de l'œdème par rapport à celle obtenue par l'aspirine. L'activité anti-inflammatoire de ces extraits pourrait s'expliquer par la présence des stéroïdes, des triterpènes, des polyphénols [27,28]. Leur mécanisme d'action correspondrait à celui des anti-inflammatoires stéroïdiens (AIS) qui consiste à l'inhibition du métabolisme de l'acide arachidonique par blocage de la phospholipase A2 au niveau des phospholipides membranaires.

51 Il est mentionné, dans plusieurs articles de synthèse, que les feuilles d’Olea europaea, contenant en quantité importante des flavonoïdes et des tanins, sont utilisées depuis longtemps comme anti-inflammatoire. Les flavonoïdes limitent la production des superoxydes en inhibant la synthèse des prostaglandines. Ces radicaux libres responsables des lésions tissulaires sont également produits par les macrophages et les polynucléaires neutrophiles au cours de la phagocytose. Selon Tapas et al. [29], les flavones et les flavonols, sous forme glycosylée ou libre comme la quercétine, le kaempférol, la myrecétine, ont une activité inhibitrice de cyclo-oxygénase (COX).

Étude de l'activité antalgique

52 Cette étude consiste à induire une action algogène par l'administration à des souris de l'acide acétique (1 %), par voie intrapéritonéale. Cette injection provoque une sensation de douleur qui se manifeste chez la souris par un mouvement d'étirement des pattes postérieures et de torsion de la musculature dorsoabdominale appelés contorsions abdominales. L'effet analgésique est apprécié par le dénombrement de ces crampes pendant 30 minutes après l'injection de l'agent algogène. Au cours du test, une forte inhibition de la douleur a été observée avec l'extrait méthanolique d’Olea europaea à 600 mg/kg avec un pourcentage d'inhibition de la douleur de 77,49 % (Tableau 4) (Fig. 5).

Tableau 4

Activité antalgique de l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea

Traitements	Dose (mg/kg)	% réduction de contractions
Extrait méthanolique d’Olea europaea	200	56,20 (b)
	400	68,21 (a)
	600	77,49 (a)
Aspirine	100	52,76 (b, c)

Activité antalgique de l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea

Fig. 5

Nombre moyen de contorsions pour chaque lot pendant dix minutes de l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea

Nombre moyen de contorsions pour chaque lot pendant dix minutes de l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea

53 L'activité antalgique a été évaluée sur des torsions provoquées par administration intrapéritonéale de la solution d'acide acétique à des souris. L'acide acétique provoque une lésion tissulaire responsable de la libération d'un certain nombre de médiateurs chimiques tels que la bradykinine, l'histamine, la sérotonine, l'acétylcholine et les prostaglandines. Ces dernières sensibilisent les nocicepteurs aux stimuli douloureux. Il en résulte une douleur plus tardive et diffuse. Cette douleur se manifeste chez les souris par un mouvement d'étirement des pattes postérieures et de torsion de la musculature dorsoabdominale [30]. L'extrait méthanolique des feuilles d'olivier inhibe les contractions abdominales de manière significative et concentration-dépendante. Cet effet analgésique pourrait être lié à l'inhibition de la libération des médiateurs chimiques. Dans notre étude, l'activité antalgique de nos extraits est liée, probablement, à la présence de certaines molécules, notamment les flavonoïdes qui sont présents avec un taux élevé. L'aspirine, par une réaction chimique d'acétylation, inhibe de façon irréversible les enzymes cyclo-oxygénases (COX 1 et COX 2), des enzymes participant à la production de prostaglandines et de thromboxanes. Elle réduit la douleur en bloquant la production des hormones responsables des messages transmis aux récepteurs de la douleur dans le cerveau d'où son efficacité sur les douleurs d'origines diverses [31,32].

Étude de l'activité cytotoxique par le test de « Brine shrimp »

54 Le pourcentage de mortalité des larves est déterminé après une exposition de 24 heures aux échantillons testés, à différentes concentrations, et les résultats sont présentés sur la figure 6. Nos résultats montrent que le pourcentage de mortalité des larves augmente avec la concentration de l'extrait métanolique des feuilles d’Olea europaea, et le maximum de mortalité (53 %) a été obtenu à partir de la concentration 100 μg/ml. Nous constatons aussi que cet extrait d'olivier ne présente aucune cytotoxicité contre les larves d’Artemia salina avec une DL₅₀ de 9 800 μg/ml. Selon Meyer et al. [33], les extraits sont non toxiques si leur DL₅₀ est supérieure à 1 000 μg/ml.

Fig. 6

Pourcentage de mortalité des larves d’Artemia salina de l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea (chaque valeur représente la moyenne de trois essais ± ET)

Pourcentage de mortalité des larves d’Artemia salina de l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea (chaque valeur représente la moyenne de trois essais ± ET)

55 À ce jour et d'après la littérature scientifique, il n'existe aucun rapport ou publication scientifique rapportant le test de cytotoxicité de l'extrait méthanolique des feuilles d’Olea europaea. Toujours dans le même sillage, des résultats similaires aux nôtres ont été rapportés par plusieurs travaux scientifiques, mais sur d'autres plantes. McLaughlin et al. [34], dans une étude sur l'utilité de ce test comme un préscreening antitumoral des extraits de plantes, ont été capable de déterminer une corrélation positive entre la mortalité des larves d'Artémia et la cytotoxicité contre les cellules KB. Ils ont permis la découverte d'acétogénines d'Annonaceae comme une nouvelle classe de pesticides naturels et d'agents antitumoraux actifs. L'étude cytotoxique réalisée dans un test de létalité contre l’Artemia salina a révélé une activité significative de deux anthraquinones (chrysophanol et physcion) avec des valeurs de DL₅₀ respectives de 289,0 et 158,1 μg/ml. Ces deux anthraquinones ont été isolées à partir de l'extrait d'éther de pétrole des racines [35].