Article de revue

Évaluation de l'activité antibactérienne des flavonoïdes de Ballota hirsuta Benth.

Pages 341 à 347

Citer cet article


  • Kechar, K.
  • et Hellal, B.
(2021). Évaluation de l'activité antibactérienne des flavonoïdes de Ballota hirsuta Benth. Phytothérapie, . 19(5), 341-347. https://doi.org/10.3166/phyto-2021-0252.

  • Kechar, K..
  • et al.
« Évaluation de l'activité antibactérienne des flavonoïdes de Ballota hirsuta Benth. ». Phytothérapie, 2021/5 Vol. 19, 2021. p.341-347. CAIRN.INFO, stm.cairn.info/revue-phytotherapie-2021-5-page-341?lang=fr.

  • KECHAR, K.
  • et HELLAL, B.,
2021. Évaluation de l'activité antibactérienne des flavonoïdes de Ballota hirsuta Benth. Phytothérapie, 2021/5 Vol. 19, p.341-347. DOI : 10.3166/phyto-2021-0252. URL : https://stm.cairn.info/revue-phytotherapie-2021-5-page-341?lang=fr.

https://doi.org/10.3166/phyto-2021-0252


Introduction

1 Les plantes de la famille des Lamiacées sont réputées actives contre une variété de micro-organismes grâce à leurs composés phénoliques [1]. C'est le cas de ballote hirsute (Ballota hirsutaBenth.), l'une des espèces les plus importantes dans la flore algérienne et des plus utilisée dans la médecine traditionnelle pour traiter nombre de pathologies. L'enquête ethnobotanique menée sur la ballote hirsute (Ballota hirsutaBenth.) a permis d'évaluer le potentiel curatif de différents organes [2]. L'étude de l'activité antioxydante des extraits de la ballote a montré que ces derniers possèdent une activité antiradicalaire [3] grâce aux substances actives qu'elle referme comme les flavonoïdes. L'objectif de notre travail dans ce cas sera d'évaluer in vitro l'activité antibactérienne des extraits de ballote hirsute selon la méthode de disques.

Description de la plante

2 La ballote hirsute est une plante vivace, rameuse et entièrement couverte d'un duvet très court. Elle appartient à la famille des Lamiacées caractérisée par des tiges ligneuses et velues de 24 à 60 cm de hauteur. Les feuilles sont ovales ou arrondies, à fortes nervures ; les supérieures sont sessiles à dents très obtuses, tandis que les inférieures sont cordiformes ou tronquées à la base. Les fleurs sont de couleur rose ou pourpre, en glomérules denses à l'aisselle des feuilles, lèvre supérieure bifide [4]. La plante évolue dans un matorral à une altitude de 789 m. Le couvert végétal est une formation naturelle à base de palmier nain (Chamaerops humilisL.), de rue de Chalep (Ruta chalepensisL.) et de rue des montagnes (Ruta montanaL.).

Matériels et méthodes

Matériel végétal

3 La ballote hirsute a été récoltée en juillet 2017 dans le mont de Tessala. Ce mont est situé à 15 km au nord-ouest de la ville de Sidi-Bel-Abbès (Algérie occidentale). Il fait partie de l'Atlas tellien. Son point culminant se trouve à 1 061 m. Les feuilles de la plante sont lavées à l'eau courante, ensuite séchées à température ambiante et à l'abri de la lumière afin de préserver au maximum l'intégrité de ces molécules. Ainsi, selon Bruneton [5], cette méthode de séchage ne dégrade pas les composés phénoliques. Les échantillons ont été ensuite broyés et tamisés pour obtenir une structure granulaire homogène, et conservés dans des flacons en verre pour des analyses ultérieures.

Préparation des extraits

Extraction par fractionnement

4 L'extraction des flavonoïdes est réalisée selon le schéma présenté par Lebreton et al. [6]. La poudre des feuilles de ballote hirsute est soumise à macération pendant une nuit à température ambiante dans un mélange hydroalcoolique méthanol/eau (7:3 v/v). L'extrait brut concentré est mélangé avec de l'eau distillée bouillante et laissé à température ambiante pendant 24 heures. Après filtration, l'extrait brut est épuisé successivement par trois solvants (l'acétate d'éthyle, le n-butanol et le chloroforme). La série d'extractions a permis d'obtenir : la fraction d'acétate d'éthyle (FAcOEt), la fraction du n-butanol(Fn-BuOH), la fraction chloroformique et la fraction aqueuse.

Calcul des rendements en extraits secs

5 Le rendement de la plante en extrait sec est déterminé en calculant le rapport suivant :

6 R (%) = P1 – P2/P3 × 100
P1 : poids du ballon avec l'extrait
P2 : poids du ballon vide
P3 : poids de la matière végétale de départ

Analyses chromatographiques

Analyse des extraits par la chromatographie sur couche mince

7 Une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autre adsorbant est fixée sur une plaque d'aluminium (20 × 20 cm) à l'aide d'un liant comme le sulfate de calcium hydraté (plâtre de Paris), l'amidon ou un polymère organique. La phase mobile est constituée par un mélange de solvants organiques avec les proportions suivantes : (v/v/v : 65/15/20) [7]. La révélation aux UV a été effectuée entre 254 nm et 365 nm.

Analyse des extraits par HPLC

8 La colonne utilisée pour séparer les composés phénoliques est exclusivement à phase inverse. Vingt microlitre des extraits ont été injectés sur cette colonne, ce système est une haute technique de résolution chromatographique largement répandue, pour la séparation et la quantification des substances phénoliques [8].

Test antimicrobien

9 La mise en évidence de la sensibilité et de la résistance des agents microbiens consiste à les mettre sur un milieu de culture solide au contact direct avec des substances testées, dans le but d'apprécier leur effet antibactérien.

Souches bactériennes

10 Face aux problèmes de la résistance bactérienne aux antibiotiques synthétiques, beaucoup de travaux ont été menés sur le pouvoir antimicrobien des extraits naturels des plantes pour traiter les différentes maladies infectieuses comme les infections nosocomiales qui sont causées par une variété de bactéries dans le milieu hospitalier, elles constituent un problème majeur de santé publique reconnu à l'échelle mondiale. C'est pourquoi notre choix s'est porté sur les souches bactériennes de référence de type ATCC (American Type Culture Collection) : Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Escherichia coli, ATCC 25922, et Staphylococcus aureus ATCC 13565.

Mode opératoire de l'aromatogramme

Préparation des dilutions de différentes fractions

11 Les extraits secs ont été repris avec le Dimethyl sulfoxyde (DMSO). Des essais témoins sont effectués in vitro pour le DMSO pur vis-à-vis de chaque type de bactéries, ces essais n'ont enregistré aucune activité inhibitrice pour toutes les souches bactériennes. Des solutions mères de 4 mg/ml sont diluées pour avoir une gamme de concentration de chaque extrait végétal : 3, 2 et 1 mg/ml.

Préparation de l'inoculum

12 Après incubation sur gélose nutritive pendant 18 à 24 heures à 37 ° C, des colonies bien isolées des souches testées sont mises en suspension dans l'eau physiologique jusqu'à une densité optique de 0,08 à 0,1 à 625 nm, soit environ 108 CFU/ml [9]. Des boîtes de Petrie stériles préalablement coulées par Muller-Hinton sont ensemencées par étalage à l'aide d'un râteau stérile de telle sorte que la distribution des bactéries soit homogène. À l'aide d'une pince stérile, les disques de papier Whatman no 1 de 6 mm de diamètre, stérilisés et imprégnés de chaque concentration, sont déposés à la surface de la gélose solidifiée. Le caractère de sensibilité ou de résistance des souches bactériennes est apprécié en mesurant le diamètre de la zone d'inhibition produite autour des disques après 24 heures d'incubation à 37 °C. Trois répétitions ont été effectuées pour chaque souche.

Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)

13 La CMI est obtenue à partir de la plus petite concentration de l'extrait végétal pour laquelle on n'observe pas de pousses bactériennes. Elle est effectuée seulement sur les extraits qui se sont montrés actifs. On procédera à des dilutions à raison géométrique de 2 à partir de la solution mère de 4 mg/ml de chaque extrait flavonoïque, ces dilutions allant de 1/2 jusqu'à 1/16 pour obtenir des concentrations de 2 à 0,25 mg/ml. Une quantité de 2 ml de chaque concentration est incorporée à 18 ml de gélose fondue et coulée dans une boîte de Petrie, après le refroidissement, chaque boîte a été ensemencée avec 10 μl de l'inoculum, la détermination de CMI est effectuée après l'incubation à 37 °C [10].

Résultats

Rendement des flavonoïdes

14 Les rendements des différentes extractions sont résumés sur la figure 1. Ils sont exprimés en pourcentage par rapport à la poudre initiale. Les extraits flavonoïques obtenus présentent un aspect liquide de différentes couleurs : vert foncé, vert clair, vert jaunâtre, marron foncé ; (F Aq) représente le poids le plus élevé suivi par (Fn-BuOH), (F AcOEt) et (FCh) (Fig. 1).

Fig. 1

Rendement des extraits selon la polarité croissante des solvants

Description de l'image par IA : Graphique à barres montrant les masses de divers composés en g/100 g de MS.

Rendement des extraits selon la polarité croissante des solvants

Chromatographie sur couche mince

15 Le système de solvant a permis de séparer plusieurs constituants et de mettre en évidence d'autres composés flavonïques où on a constaté que le nombre de taches dans la fraction d'acétate d'éthyle et dans la fraction chloroformique est de l'ordre de six. Tandis que dans la fraction butanolique et la fraction aqueuse une seule tache est apparue (Fig. 2). En comparaison avec les facteurs de rétentions (Rf) des témoins testés, nous avons pu identifier trois composés appartenant à la classe des flavonols, rutine et quercétine dans la fraction acétate et catéchine dans la fraction chloroformique.

Fig. 2

CCM analytique représentative des flavonoïdes de Ballota hirsuta

Description de l'image par IA : Quatre fractions de Ballota hirsuta : n-BuOH, AcOEt, CHCl3, Aq.

CCM analytique représentative des flavonoïdes de Ballota hirsuta

1: fraction n-BuOH ; 2 : fraction (AcOEt) ; 3 : fraction (CHCl3) ; 4 : fraction (Aq)

Lecture des profils chromatographiques de HPLC

16 Les spectres HPLC et le temps de rétentions des standards : naringine (6,2 minutes), taxifoline (7,8 minutes) et sylibine (8,2 minutes) ont été fournis par le groupe pharmaceutique SAIDAL. La comparaison des temps de rétention des standards avec ceux enregistrés dans les spectres de la fraction acétate et n-butanol permet l'identification probable de certains flavonoïdes dans ces extraits.

Tests de sensibilité

17 Suivant le diamètre de la zone d'inhibition exprimé en millimètres autour de chaque disque, la lecture des résultats est faite comme suit [11] :

18 résistante (–) : diamètre ≤ 8 mm ; modérément sensible (+) : diamètre compris entre 8 et 14 mm ; sensible (++) : diamètre compris entre 14 et 20 mm ; extrêmement sensible (+++) : diamètre ˃ 20 mm.

19 Staphylococcus aureus ATCC et Escherichia coli ATCC s'avèrent très sensibles aux dilutions de la fraction chloroformique et la fraction n-BuOH (Fig. 3) en présentant les diamètres des zones d'inhibition les plus élevés. Cependant, les fractions aqueuse et d'acétate d'éthyle se sont révélées moins actives sur les trois souches bactériennes testées.

Fig. 3

Le spectre HPLC de l'extrait acétate d'éthyle des feuilles de Ballota hirsuta Benth

Description de l'image par IA : Courbe HPLC avec pics à 3.650, 4.734, 7.724, 11.450 et 12.714 minutes.

Le spectre HPLC de l'extrait acétate d'éthyle des feuilles de Ballota hirsuta Benth

20 Pseudomonas aeruginosa ATCC présente une faible sensibilité vis-à-vis des quatre extraits, sauf que cette activité est apparue à la concentration la plus élevée de l'extrait chloroformique avec un diamètre d'inhibition (18 ± 1 mm) (Tableau 1).

Tableau 1

Résultats de l'activité antibactérienne

Souches bactériennes
Fraction obtenue Concentration Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
Ø d'inhibition en mm ± écart-type Sensibilité Ø d'inhibition en mm ± écart-type Sensibilité Ø d'inhibition en mm ± écart-type Sensibilité
F-AcOEt 4 mg/ml 3 mg/ml 2 mg/ml 1 mg/ml 19,6 ± 1,5 17,6 ± 0,5 13 ± 1 9 ± 1 7,3 ± 1,5 CMI = 0,5 mg/ml ++ ++ +– – 18,3 ± 0,5 14,6 ± 1,1 11,3 ± 0,5 8 ± 1 7,3 ± 0,5 CMI = 0,5 mg/ml ++ ++ + + 10,6 ± 2 8,6 ± 1,5 6 ± 1 0 0 + +– – –
F-n-BuOH 4 mg/ml 3 mg/ml 2 mg/ml 1 mg/ml 28 ± 2 20,6 ± 2 15,3 ± 1,5 8,3 ± 2,5 6 ± 1 CMI = 1 mg/ml +++ ++ ++ – – 30,6, ± 1,1 28 ± 1,7 17,6 ± 2 10,6 ± 1,1 7,3 ± 0,5 CMI = 0,5 mg/ml +++ +++ ++ + – 15 ± 1 12 ± 1 7,6 ± 0,5 0 0 ++ +– – –
F-Aq 4 mg/ml 3 mg/ml 2 mg/ml 1 mg/ml 19 ± 2,6 12,3 ± 0,5 7,6 ± 1,1 0 0 CMI = 2 mg/ml ++ +– – – 15 ± 1 13,6 ± 1,1 8 0 0 ++ + – – – 13 ± 1,7 8,3 ± 2,5 0 0 0 +– – – –
F-Ch 4 mg/ml 3 mg/ml 2 mg/ml 1 mg/ml 34,6 ± 1,1 22,6 ± 2 15 ± 1 8,6 ± 2 6 ± 1 CMI = 1 mg/ml +++ +++ + – – 31,6 ± 1,5 20,6 ± 1,1 15,3 ± 15, 12,6 ± 1,1 11,3 ± 1,1 CMI = 0,25 mg/ml +++ ++ ++ + + 18 ± 1 15,3 ± 1,5 10 ± 1 6,6 ± 1,5 0 CMI = 2 mg/ml ++ ++ +– –
Description de l'image par IA : Tableau avec résultats d'activité antibactérienne pour différentes concentrations et souches bactériennes.

Résultats de l'activité antibactérienne

Discussion

21 Il est difficile de comparer ces résultats avec ceux de la bibliographie, car le rendement d'extraction n'est que relatif et semble être lié aux propriétés génétiques de l'espèce utilisée, à la nature des organes pour une même espèce, à l'origine géographique, aux conditions de récolte [12,13] et aux méthodes d'extraction appliquées.

22 Quatorze composés ont été observés, regroupant toutes les fractions. En comparant les Rf ainsi que la coloration sous UV à ceux des standards réalisés dans les mêmes conditions opératoires, on a pu identifier la rutine et la quercétine dans la fraction acétate, la catéchine a été détectée dans la fraction chloroformique. La présence de ces deux types de flavonoïdes connus pour leurs vertus pharmacologiques [14] est probablement à l'origine des différentes activités biologiques attribuées à l'espèce étudiée. Ces résultats sont en accord avec ceux qui ont déjà été publiés pour les Lamiacées ; les flavanols sont identifiés dans Satureja obovata [15]. La quercétine, la lutéoline, l'apigénine et la catéchine ont été isolées d’Ajuga iva [16]. Les travaux de Ferreres et al. [17] indiquaient que 14 flavonoïdes ont été identifiés par analyse chromatographique dans les parties aériennes de la ballote hirsute (Ballota hirsutaBenth.), dont huit aglycones (savigenin, kumatokenin…) et six glucosides (lutéoline-7-glucoside,quercétine-3-glucodide).

23 Les résultats de HPLC montrent que la fraction acétate d'éthyle referme 16 composés flavonoïques, quatre d'entre eux sont majoritaires et 12 sont minoritaires. Cependant, la fraction n-butanol contient dix composés, deux étaient majoritaires. On a pu identifier la naringine dans la fraction n-BuOH, la sylibine et la taxifoline dans la fraction acétate. Plusieurs travaux antérieurs ont confirmé que la fraction acétate s'est montrée la plus riche en différentes substances flavonoïques. Ces constatations sont en accord avec les résultats de la chromatographie sur couche mince (CCM) qui révèlent la présence de la majorité des standards testés dans la fraction acétate. Le type et la quantité de ces substances varient on fonction de la croissance et de la maturité de la plante, même les conditions écologiques doivent être prises en compte.

24 Les résultats de l'activité antibactérienne obtenus révèlent un pouvoir inhibiteur considérable de la fraction n-BuOH et chroformique vis-à-vis des souches testées. Cependant, l'extrait acétate s'est montré faible. Il a été rapporté par Ćetković et al. [18] que l'extrait d'acétate d'éthyle de Satureja montana présente une bonne activité contre Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus par rapport à l'extrait n-butanol, ce qui n'était pas le cas pour nos extraits. Les différences trouvées peuvent être attribuées à plusieurs facteurs tels que la nature du composé, la membrane de la souche testée, la saison de prélèvement, le solvant utilisé pour l'extraction et les endroits où l'espèce pousse. Néanmoins, la méthode utilisée pour l'évaluation de l'activité antibactérienne, la méthode de diffusion à partir des puits sur gélose ou la méthode de diffusion en milieu gélosé, influe aussi sur les résultats [19]. Généralement, toutes les plantes de la famille des Lamiacées sont connues actives contre une variété de micro-organismes pour leurs composés phénoliques [20].

25 Ces résultats apportent des éléments de validation scientifique de l'usage traditionnel des plantes médicinales, en particulier Ballota hirsuta. Les informations reçues auprès des enquêtés de la préfecture de Sidi-Bel-Abbès de l'Algérie occidentale révèlent que les extraits de la ballote hirsute sont utilisés par les hommes et les femmes comme désinfectant contre certains germes bactériens [2]. L'utilisation abondante des feuilles sous diverses formes est à mettre en parallèle avec l'abondance des familles chimiques présentes dans cet organe. Les résultats sont en concordance avec plusieurs travaux montrant que la famille la plus représentée dans les observations d'ethnopharmacomédecine est celle des Lamiacées [21].

26 Cowan [22] supposait que les flavonoïdes dépourvus des groupements hydroxyles libres ont plus d'activité antimicrobienne par rapport à ceux qui en sont pourvus, ce qui conduit à une augmentation de leur affinité chimique aux lipides membranaires. On peut donc supposer que la cible microbienne de ces extraits est la membrane cytoplasmique. La présence de composés actifs dans les différentes fractions obtenues pourrait leur conférer cette activité inhibitrice, les alcools possèdent une activité microbicide plutôt que microbiostatique [23]. Selon Burt [24], il est très probable que leur activité ne soit pas attribuée à un seul mécanisme d'action spécifique, mais à plusieurs agissant simultanément. L'activité antibactérienne des flavonoïdes peut être expliquée aussi par le mécanisme de toxicité vis-à-vis des micro-organismes qui se fait par des interactions non spécifiques telles que l'établissement des ponts hydrogènes avec les protéines des parois cellulaires ou les enzymes, la chélation des ions métalliques, l'inhibition du métabolisme bactérien, la séquestration de substances nécessaires à la croissance des bactéries [25]. Certaines études ont montré que l'activité (antimicrobienne, antivirale, insecticide, larvicide et ovicide) des substances naturelles est supérieure à celle de leurs composés majoritaires testés séparément, les composés minoritaires ont un rôle déterminant dans l'activité microbienne, ils pourraient avoir un effet synergétique avec les composés majoritaires [24]. Selon Lamarti et al [26], il existe une synergie entre le carvacrol et son précurseur biologique, le p-cymène (molécules terpéniques) : la présence de p-cymène permet au carvacrol de pénétrer plus facilement dans la cellule de la souche bactérienne. Plusieurs travaux ont mis en évidence la grande sensibilité des bactéries à Gram positif par rapport aux Gram négatif [27]. Cela peut être attribué à la différence dans les couches externes des bactéries à Gram négatif et à Gram positif. Les bactéries à Gram négatif, indépendamment de la membrane des cellules, possèdent une couche additionnelle (la membrane externe) qui inhibe la diffusion de certaines molécules actives. Pseudomonas aeruginosa présente une résistance contre les quatre extraits par rapport aux autres souches, car elle est naturellement résistante aux nombreux antibiotiques et aux substances actives. Cette multirésistance est la conséquence de l'action conjuguée de trois phénomènes : faible perméabilité de la membrane externe de sa paroi qui est constituée de phospholipides et des lipopolysaccharides, faible affinité pour les cibles des antibiotiques et production naturelle d'une céphalosporinase chromosomique inductible [28].

Conclusion

27 Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l'évaluation du potentiel antimicrobien des extraits flavonoïques des feuilles de Ballota hirsutaBenth., plante de la famille des Lamiacées.

28 Les résultats de CCM ont montré que l'extrait de l'acétate d'éthyle et chloroformique referme un nombre important de composés flavonoïques qui pourraient être responsables de l'activité biologique de cette espèce. L'analyse chromatographique de l'HPLC (Figs 3,4) a permis d'apporter un complément sur le profil phytochimique des fractions obtenues. En effet, les tests antibactériens des extraits réalisés in vitro par la méthode de diffusion sur gélose Mueller-Hinton sur trois souches (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa) ont montré que l'extrait de l'acétate d'éthyle a manifesté une activité inhibitrice modérée (Fig. 5). En revanche, l'extrait chloroformique et n-butanol ont présenté une bonne activité vis-à-vis des trois bactéries testées. Ces effets varient en fonction du type d'extrait flavonoïque et de ses concentrations et même de la nature bactérienne.

Fig. 4

Le spectre HPLC de l'extrait acétate d'éthyle des feuilles de Ballota hirsuta Benth

Description de l'image par IA : Courbe HPLC avec pics marqués en minutes et unités d'absorbance.

Le spectre HPLC de l'extrait acétate d'éthyle des feuilles de Ballota hirsuta Benth

Fig. 5

Effets inhibiteurs de la fraction chloroformique vis-à-vis de Staphylococcus aureus, de Pseudomonas aeruginosa et d'Escherichia coli

Description de l'image par IA : Trois boîtes de Petri avec des concentrations de mg/ml.

Effets inhibiteurs de la fraction chloroformique vis-à-vis de Staphylococcus aureus, de Pseudomonas aeruginosa et d'Escherichia coli

Liens d'intérêts :

les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d'intérêts.

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Mots-clés éditeurs : Activité antibactérienne, Ballota hirsuta, Benth., CCM, Flavonoïdes, HPLC

Date de mise en ligne : 26/09/2024

https://doi.org/10.3166/phyto-2021-0252